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　　二十二碳六烯酸（DHA）是人体重要的n-3多不饱和脂肪酸，具有促进脑神经系统发育、保护心血管健康、提高免疫力、抗炎、抗癌等功效。DHA的传统生产方法是从鱼油中提取，但存在诸多缺点，目前更安全健康的新兴生产方式是利用微生物发酵生产DHA，与传统方法相比，微生物发酵无异味、DHA纯度高、易吸收。现在常用的微生物有两类，分别是藻类和色菌类，色菌类主要有裂殖壶菌Aurantiochytrium（又称Schizochytrium）、破囊壶菌Thraustochytrium，原生生物中的裂殖壶菌因累积的脂质占菌体干质量的40%～70%，脂肪酸组分相对简单，DHA质量分数在20%～50%，且所产脂肪酸90%以上是以人体易吸收的甘油三酯形式存在，成为工业化生产DHA使用最多的菌株。

　　在发现裂殖壶菌具有生产DHA的能力后，科研人员进行了一系列工作，例如高产菌株的分离和选育、发酵条件的优化、脂质合成机制的探究。除此之外，裂殖壶菌还可以作为脂质代谢研究的模式生物，目前的研究着重于探究裂殖壶菌高产DHA的机制，并利用其独特的机制进行分子改造以突破生产瓶颈。近年来随着测序和质谱技术的发展，已获得了一系列的基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白质组学数据，例如在最近的一项代表性研究中，通过对Schizochytrium sp.S31不同培养阶段的多组学研究，揭示了其脂质转化的机制。此外，由于其高DHA合成能力，裂殖壶菌已成为PUFA合成酶性质研究的宝贵资源，已广泛应用于其他生物PUFA合成途径的构建（图1）。

　　2015年研究人员采用二代测序（Illumina HiSeq 2000）技术完成了裂殖壶菌（CC M209059）的第一次全基因组测序，这也是破囊壶菌科（Thraustochytriaceae）中报道的第一个测序物种，随后裂殖壶菌的基因组组装和注释接连公布，2016年和2018年分别发布了Aurantiochytrium sp.T66和Aurantiochytrium sp.KH105的基因组组装和注释。表1汇总了裂殖壶菌及其相近菌株的基因组学概况。采用二代测序技术得到的裂殖壶菌基因组大小大多在40 Mb左右，而三代测序得到的裂殖壶菌基因组大小一般都大于60 Mb，其中Aurantiochytrium sp.KH105GC基因组大小约为97 Mb，远大于60 Mb，Iwasaka等认为其基因组过大可能由于有大约21%的基因组是重复或未组装的序列。裂殖壶菌基因组GC相对含量为45%～62.8%，平均可以预测到约11 000 个编码蛋白质的基因。

　　在Aurantiochytrium sp.SW1、S.limacinum B4D1、Schizochytrium sp.TIO01和A.mangrovei的基因组中均发现了编码FAS复合体的基因序列，并且具有极高的同源性。如果通过FAS途径合成DHA至少需要δ4去饱和酶、δ5去饱和酶、δ6去饱和酶、δ9去饱和酶、δ12去饱和酶、δ15去饱和酶、C16延长酶、δ5延长酶、δ6延长酶。在已经完成基因组测序的菌株中，Aurantiochytrium sp.SW1基因组中没有检测到δ12去饱和酶、δ15去饱和酶、δ6去饱和酶等关键酶基因，在Schizochytrium sp.HX-308基因组中只检测到了δ12去饱和酶、δ8去饱和酶、δ6去饱和酶和一个延长酶，在S.limacinum SR21基因组中鉴定到δ4去饱和酶、δ5去饱和酶、δ1延长酶、δ3延长酶、δ4延长酶、δ6延长酶，其中δ6延长酶可以催化十八碳四烯酸为二十碳四烯酸，其他延长酶功能尚未介绍。这说明在裂殖壶菌及其亲缘菌株中，FAS-延长酶/去饱和酶途径大部分是不完整的。

　　目前通过基因组分析到的PUFA合成酶主要分为两种类型：一类与II型PKS相似，是由多个单功能酶组成的复合体；一类与I型PKS相似，是由几个催化和功能结构域构成的多功能蛋白。2001年Metz等已经通过对Schizochytrium的cDNA进行测序鉴定，得到3 个编码PUFA合成酶的开放阅读框（orf），共含有11 个结构域（图4），随后Hu Fan等也在Schizochytrium sp.TIO01基因组中发现了3 个不含内含子的巨大基因，编码PUFA合成酶的3 个亚基（A、B和C）（NCBI中的LOCUS号分别为AF378327、AF378328、AF378329），这类似于II型PKS，其结构域包括KS、MAT、ACP、KR、DH催化的ER、CLF、AT。但在S.limacinum SR21中检测到了一个类似于I型PKS的多功能蛋白（schi20060510），其结构域包括KS、MAT、ACP、KR和DH，以及零星分布在基因组上与PKS和FAS相关的结构域（1 个KS、7 个ER、2 个AT和1 个MAT）。Aurantiochytrium sp.SW1中有两个基因与S.limacinum SR21中的PUFA合成酶复合体的编码基因部分同源，有3 个基因与Schizochytrium sp.ATCC 20888中PUFA合成酶三亚基（A、B和C）的编码基因同源，因此有学者认为两种类型的PUFA合成酶都存在于Aurantiochytrium sp.SW1。目前虽然已经在多个裂殖壶菌基因组中注释了PUFA合成酶通路的相关结构域，但裂殖壶菌PUFA合成酶的具体结构仍然没有解析。

　　对于不同的裂殖壶菌菌株，转录组学可以探究其关键基因的转录差异。Bao Zhendong等经过连续培养将Schizochytrium sp.H016分化为高脂质含量亚群（H016-H）和低脂质含量的亚群（H016-L），通过比较两种菌株的在不同时间的转录组，发现H016-H具有脂肪酸合成、甘油三酯积累等途径相关基因的高表达，细胞生长、脂质降解等途径相关基因的低表达特征。Sun Xiaoman等以30 g/L NaCl作为高盐胁迫诱导剂对Schizochytrium sp.HX-308进行150 d的适应性实验室进化（ALE），得到进化菌株ALE150，该菌株细胞干质量和脂质产量分别比起始菌株提高了32.7%和53.31%，转录组学分析发现进化菌株编码抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT））的基因以及中心碳代谢、转氢酶循环和FAS等途径相关基因的表达均发生上调。

　　裂殖壶菌自身具有较强的PUFA积累能力，而特定营养或环境胁迫会诱导其胞内脂质积累量大幅提高，其最先做出的响应往往发生在转录调控层面，激发自身的抗逆信号响应途径，进而引发全局性的代谢改变。葡萄糖和甘油作为裂殖壶菌最常见的碳源，本课题组前期完成了对Aurantiochyrium limacinum SFD-1502分别以葡萄糖和甘油作为唯一碳源培养过程的时间序列转录组分析，确定甘油培养条件下PUFA合成酶基因上调，而Chen Wei等持不同观点，认为甘油培养激活了Schizochytrium sp.S056传统脂肪酸合成途径，Ye Huike等通过葡萄糖和甘油混合碳源提高了Thraustochytriidae sp.PKU#Mn16的生物量和DHA产量，通过转录组分析发现混合碳源代替葡萄糖培养会促进PUFA合成酶通路相关基因的表达并抑制β-氧化通路相关基因的表达，这也是总脂质和DHA产量增加的主要机制。除碳源外，氮源也是影响DHA合成的重要因素，Wang Dongsheng等以玉米浆作为氮源，通过比较培养基中不同玉米浆添加量对Aurantiochytrium sp.YLH70转录组的影响，发现限氮培养可使编码乙酰辅酶A羧化酶和乙酰辅酶A合成酶的两个基因表达上调，从而促进脂肪酸前体（丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A）生成诱导脂肪酸合成，而富氮培养会促进更多的碳通量进入三羧酸（TCA）循环，促进氨基酸和蛋白质的合成，从而促进细胞生长，且在限氮培养条件下PUFA合成酶亚基A、B和C的表达水平与氮浓度呈反比，FAS相关途径的基因表达水平与之相反。除此之外，盐胁迫、氧胁迫、冷胁迫和外源添加物所造成的环境变化都会使裂殖壶菌的基因表达特征发生变化，具体信息详见表2。

　　2015年，Ling Xueping等首先优化了Schizochytrium sp.LU310提取蛋白质和去除脂质的方法（利用15 kpsi均质器进行破壁（两个循环），利用冷处理去除脂质），利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离，通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）仪鉴定出了3 种不同的FAS和1 种热休克蛋白，观察了Schizochytrium sp.LU310在不同生长阶段其表达蛋白质的不同，并发现FAS合成酶和PUFA合成酶C亚基在72 h表达量增多。蛋白质组学中，SDS-PAGE结合MALDITOF-MS/MS被认为是比较蛋白质组学中广泛应用的蛋白质分析方法，因为与传统的双向电泳（2-DE）相比，其效率更高、重复性更好。Ma Zengxin等研究了Aurantiochytrium sp.SD116在冷胁迫下的蛋白质组学变化，选择三氯乙酸-丙酮沉淀结合苯酚萃取作为提取方法，采用2-DE分离，共检测了大约700 个蛋白点，由于2-DE技术在分离高分子质量蛋白方面有局限性，因此利用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）标记，共检测到了4 650 种蛋白，并通过质谱检测成功识别到大于53%的蛋白。研究结果表明：在低温条件下中心代谢途径受到抑制，磷酸戊糖途径被增强以补充能量和NADPH的供应，PUFA合成酶的表达和翻译上调了2 倍以上，以保证低温条件下细胞内膜结构和功能的完整性。之后在碳源代谢方面，Shene等比较了T.striatum AL16在淀粉和葡萄糖中生长的蛋白质组学分析结果，发现ATP合成酶在有葡萄糖的培养基中积累，而苹果酸脱氢酶在淀粉培养基中更为丰富（表3）。

　　同样，基因操作对细胞内产生的代谢变化也可以通过代谢组分析。Li Zhipeng等通过同源重组破坏Schizochytrium sp.ATCC MYA 1381中PUFA合成酶基因簇中的CLF和DH，使得生产PUFA的产量明显下降，SFA的产量明显上升，通过比较基因删除菌株与原始菌株之间的代谢组，发现这两个基因的破坏导致主要代谢产物减少，并抑制细胞内代谢活性，推测其原因是PUFA作为细胞膜的主要成分，其含量减少会影响细胞膜对底物的摄取与利用，从而影响细胞生长；同时Li Zhipeng等通过过表达MAT，使脂质和PUFA的浓度分别增加了10.1%和24.5%，代谢组学分析显示在工程菌株中麦角甾醇含量显著增加，其可以通过改善膜的流动性和渗透性，加速葡萄糖吸收；TCA循环的代谢产物减少，甲羟戊酸途径中胡萝卜素含量减少，从而使得碳通量被定向到PUFA的合成。

　　由于初期裂殖壶菌研究尚浅，基因组信息尚不完整，科研人员常选择首先进行全基因组测序，之后进行有参转录组，通过与参考基因组比对进行分析，部分科研人员选择无参转录组进行转录本组装，构建unigene库，然后进行后续分析。裂殖壶菌DHA合成是多层次网络相互调节作用的结果，单一组学的数据不足以全面、真实地反映细胞的代谢活动。近些年，多组学整合分析在微生物中的应用逐渐增多，如转录组-代谢组整合、蛋白组-代谢组整合以及3 种及以上组学的整合分析。由于未测序物种基因数据库的缺失导致蛋白质鉴定困难、蛋白质提取分离造成的蛋白损失导致鉴定到的蛋白质数量有限等蛋白质组学的技术局限性，使得裂殖壶菌的组学联用多为转录组-代谢组联用。

　　随着生物技术的不断发展，研究人员应用转录组学、蛋白质组学及代谢组学等测序技术获得了不同菌株、不同培养条件之间差异表达的基因、蛋白质以及代谢物。挖掘和鉴定裂殖壶菌在特殊条件下脂质积累的重要调控途径及特异功能蛋白、关键基因以及代谢物等，可加深对裂殖壶菌高产DHA机制的理解。大量研究表明，裂殖壶菌胞内DHA积累对培养环境及营养条件敏感，特定的环境及营养能够诱导裂殖壶菌胞内DHA大量积累，比如甘油培养有利于促进胞内DHA的积累，但甘油培养与葡萄糖培养相比也会导致底物消耗速率的减慢，因此，基于甘油和葡萄糖的混合培养调控策略一直未能很好地应用到裂殖壶菌DHA高效合成中，而组学技术能够从系统水平考察不同碳源条件下裂殖壶菌胞内细胞代谢及脂质代谢情况，从不同尺度确定碳源影响裂殖壶菌脂质积累的关键代谢途径和生物学过程，解析碳源诱导裂殖壶菌脂质积累的机制，有助于从全局角度提出更为精准地调控脂质合成的策略。