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　　SecondaryStructureofProteins 到目前为止，研究蛋白质高级结构的方法 仍然是以X射线衍射法(X-raydiffractionmethod) 为主，原理是：当X射线nm)投射到蛋白 质晶体样品时，蛋白质分子内部结构受到激发， 入射线反射波互相叠加产生衍射波，衍射波含 有被测蛋白质构造的全部信息，通过摄影即可 得一张衍射图案(diffractionpattern)，再用电脑 进行重组，即可绘出一张电子密度图(electron densitymap)。从电子密度图可以得到样品的三 维分子图象，即分子结构的模型。 蛋白质分子的多肽链并非呈线形伸展，而 是折叠和盘曲构成特有的比较稳定的空间结构。 蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空 间结构的完整。仅测定蛋白质分子的氨基酸组 成和它们的排列顺序并不能完全了解蛋白质分 子的生物学活性和理化性质。例如球状蛋白质 （多见于血浆中的白蛋白、球蛋白、血红蛋白 和酶等）和纤维状蛋白质（角蛋白、胶原蛋白、 肌凝蛋白、纤维蛋白等），前者溶于水，后者 不溶于水，此种性质不能仅用蛋白质的一级结 构的氨基酸排列顺序来解释。 一级结构决定了二级结构： Chou和Fasman对29种蛋白质的一级结构和二级 结构关系进行统计分析，发现： Glu、Met、Ala和Leu残基是α-螺旋最强的生成者， Gly、Pro是α-螺旋最强的破坏者 Gly、Ala、Ser是β折迭最强生成者 Gly、Pro、Asp、Ser是β转角最强生成者， Ile、Val、Leu是β转角最强破坏者。 一级结构决定了三级结构：如牛胰核糖核酸酶 一级结构决定了四级结构：如血红蛋白的四级结构， 见球状蛋白质。 一个经典蛋白质的共价骨架含有数百个化 学键，由于围绕这些化学键发生的可能的自由 旋转，蛋白质分子可能有无限个空间构象。然 而每个蛋白质具有一种特定的化学或结构上的 功能，表明每一种蛋白质只有一个唯一的三维 结构。1920s后期，几种蛋白质被结晶，包括血 红蛋白（Mr64500）和脲酶（Mr48300），表 明多数蛋白质能被结晶，即使非常大的蛋白质 也能形成唯一的结构，支持蛋白质结构和功能 之间的必然关系。 NativeProteins 蛋白质中原子的空间排列是蛋白质的构象， 一个蛋白质的可能构象包括在不打破共价键的 前提下的任意的结构状态。如单键旋转可以导 致构象的改变。一个蛋白质分子中有数百个单 键，理论上存在无数的构象，生理条件下，会 呈现一个或几个主要的构象状态。在特定条件 下存在的构象通常是热力学上最稳定的构象， 具有最低的自由能。处于功能及折叠状态构象 的蛋白质被称为天然蛋白质（nativeproteins）。 蛋白质结构上的稳定性可以定义为维持天 然蛋白质构象的趋势或能力。天然蛋白质是稳定 的，生理条件下拆开蛋白质折叠及非折叠状态所 需要的能量在20-65kJ/mol。 打破一个单的共价键需要200-460kJ/mol， 而弱的作用力在4-30kJ/mol。单个共价键对维持 蛋白质构象的作用要比单个非共价键作用的要强 得多。但由于非共价作用的数量多，非共价作用 仍然是维持蛋白质结构的主要作用。通常具有最 低自由能的蛋白质构象（最稳定的构象）是最大 数量弱相互作用力所维持的那种。 氢键：α-螺旋，β-折叠尿素，盐酸胍 （guanidinehydrochloride） 疏水作用：形成球蛋白的核心去垢剂，有机溶剂 VanderWaals力：稳定紧密堆积的基团和原子 离子键：稳定α-螺旋，三、四级结构酸、碱 二硫键：稳定三、四级结构还原剂 配位键：与金属离子的结合螯合剂EDTA H2NC(:NH)NH2HCl 生理条件下，蛋白质分子氢键和离子键的 形成主要是由相同熵效应所驱动的。极性基团 与水形成氢键，溶解于水。然而对于每个单位 质量(unitmass)氢键的数量，纯水的要比其他液 体或溶液的要大。所以即使是最强极性的分子， 它的溶解性也是有限度的，因为它们的存在导 致了每个单位质量氢键的净减少。 因此极性分子的周围会形成一个结构化了 的水的水化层(solvationshell)。尽管在一个大分 子内两个极性基团形成的分子间的氢键或离子 键作用的自由能主要被消除相同基团与水之间 的这种相互作用所抵消，但在分子间相互作用 形成时，结构化了的水的释放提供了一个折叠 所需要的熵的驱动力。 蛋白质的内部通常是疏水氨基酸侧链紧密 包裹的核心。蛋白质内部任何极性的或带电的基 团都有一个可以形成氢键或离子作用的配体。一 个氢键对于一个天然结构的稳定性几乎没有贡献， 但在一个蛋白质的疏水核心内如果存在没有相应 配体的氢键作用或带电基团，对蛋白质的构象是 绝对不稳定的，热力学上也是不能成立的。蛋白 质中基团间氢键的形成是协同的，一个氢键的形 成可以促进其他氢键的形成。所有氢键及其他非 共价作用对稳定蛋白质的构象的作用仍在讨论， 带电相反基团间形成的离子对（盐桥）也是稳定 蛋白质天然构象的贡献。 • • • αβ Module domain - Inthelate1930s,LinusPaulingand RobertCoreyembarkedonaseriesof studiesthatlaidthefoundationforour presentunderstandingofproteinstructure. Theybeganwithacarefulanalysisofthe peptidebond. Eachpeptidebondhassomedouble-bond characterduetoresonanceandcannot rotate. 六个原子（-Cα—CO—NH—Cα-）基本上同处于一个平面，这 就是肽键平面。肽链中能够旋转的只有α碳原子所形成的单键， 此单键的旋转决定两个肽键平面的位置关系，于是肽键平面成 为肽链盘曲折叠的基本单位。 相邻氨基酸残基的 -碳原子被3个共价键隔开 一般C=N双 键(0.128nm) 肽键的C及N周围 三个键角之和均 为360° 肽键C-N的双键特性限制了肽键的旋转， 肽链上重复出现的肽键平面成为肽单位(peptide unit)或肽基(peptide group)。肽链主链上只有 碳原子链接的两个键是单键，可自由旋转。为 表示C 旋转形成的键角，将N-C 的键角标为， C -C的键角标为。当多肽处于完全伸展构象 即所有肽基处于同一平面时，和为180 0 ，因 此和可以是-180 0 和+180 0 之间的任意值。但由 于肽链骨架和氨基酸侧链之间原子的立体干扰 会阻止其中很多值的出现。 Cα 多肽链的所有可能构象 都能用和两个构象角 （conformational angle) 或称二面角（dihedral angle)来描述。 蛋白质的二级结构(secondary structure)是指多 肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉 及侧链部分的构象。 Pauling等人对一些简单的 肽及氨基酸的酰胺等进行了X射线年预测了蛋白质的二级结构。 和均为180 0 ，为完全伸展的肽链构象。 和均为零 时的构象， 由于相邻肽 平面的H原 子和O原子 之间在空间 上重叠，此 构象实际上 并不允许存 在。和同 时旋转180 0 ， 则转变为完 全伸展的肽 链构象(前 页)。 Ramachandran plot • 印度生物物理学家G. N. Ramachandran，第 一个计算出sterically allowed region。他以角 和角为坐标轴，作出Ramachandran plot， 可以精确地从蛋白质的结构里画出除glycine外 的所有氨基酸。 • 阐述蛋白质或肽立体结构中肽键内α碳原子和 羰基碳原子间键的旋转度对α碳原子和氮原子 间键的旋转度所绘制的图，主要用来指明蛋白 质或肽类允许和不允许的构象。 Ramachandran Plot -Ala residue 深蓝域表示在没有立体 重叠即完全允许时的构象； 中等蓝域表示处于极端 限制情况下不利的原子接触 时所允许的构象；浅蓝 域表示在键角允许有一些可 变性的情况下的构象。 图中的不对称性来自L-立体化学 的氨基酸残基，其他带有非分支 侧链的L-氨基酸残基的结果基本 一致。对分支氨基酸如Val, Ile及 Thr，允许的区域要比Ala的要小, Gly的区域要大，Pro所允许的区 域要受到非常严格的限制 Protein Secondary Structure The term secondary structure refers to the local conformation of some part of the polypeptide. The discussion of secondary structure most usefully focuses on common regular folding patterns of the polypeptide backbone. The most prominent are the helix and  conformations. 指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链 骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。二 级结构以一级结构为基础，多为短距离效应。分为： α-螺旋：多肽链主链围绕中心轴呈有规律地螺旋式上升，顺 时钟走向，即右手螺旋，每隔3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距 为0.54 nm。α-螺旋的每个肽键的Ｎ-Ｈ和第四个肽键的羧基氧形 成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平形。 β-折叠：多肽链充分伸展，各肽键平面折叠成锯齿状结构， 侧链Ｒ基团交错位于锯齿状结构上下方；它们之间靠链间肽键羧 基上的氧和亚氨基上的氢形成氢键维系构象稳定． β-转角：常发生于肽链进行180度回折时的转角上，常有４ 个氨基酸残基组成，第二个残基常为脯氨酸。 无规卷曲：无确定规律性的那段肽链。 主要化学键：氢键。 • α-helix keratin triple helices collagen triple helices • β-sheet • β-turn Linus Carl Pauling (1901-1994) 1926年，留学Sommerfeld实验室（1年7个月） 1928年，发明杂化轨道， 创立量子化学 1930年，去Laurence Bragg实验室学X-ray衍射 1936年，与Mirsky一起发表蛋白质变性的理论---氢键 1937年，开始搭α-helix的模型，发现5.4A的周期，与 Astbury的 Keratin蛋白测定得到的5.1A不符。此后化了约10年的时间测 定各种含肽键的小分子的结构，得出肽键的6个原子在同一平 面上的结论 1949年，人造丝X-ray数据发表，他看到了5.4A的周期 1950年， α-helix模型发表，次年发表β-sheet模型 1954年，Nobel化学奖 1964年，Nobel和平奖 70年代，提倡Vitamin C治百病 80年代，盐湖城丑闻 螺旋是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结 构。螺旋中的每个氨基酸残基C 的成对二面角的和 各自取同一数值，=-57 0 、=-48 0 ，即形成周期性有规 则的构象。多肽的主链可以按右手方向或左手方向盘 绕形成右手螺旋或左手螺旋。每周螺旋占3.6个氨基酸 残基、沿螺旋轴方向上升0.54 nm、每个氨基酸残基绕 轴旋转100 0 ，沿轴上升0.15 nm。 螺旋中氨基酸残基 的侧链伸向外侧，相邻螺圈之间形成链内氢键，氢键 的取向与中心轴几乎呈平行关系。氢键由肽键上的N- H的氢与其后面（N端）的第四个氨基酸残基上的C=O 的氧之间形成。 α （a）右手 螺旋的 形成，刚性的肽键 平面与螺旋的长轴 平行。 （b）右手 螺旋的 球-棍模型，显示链 内氢键，重复的单 位是单个螺旋的重 复，3.6个氨基酸残 基构成一个螺旋。 从一个末端看到 的 螺旋状态，由 长轴的上端往下 看，显示R基团的 位置。球-棍模型 用于强调螺旋的 排列。因为球不 能表现出单个原 子的范德华半径， 图示的空心螺旋 是个假象(见d图模 型)。 O----------------------------H --C-[-NH-C -HR-CO-] n=3 -N— N端 C端 这里，n=3表示氢键封闭的环内共包括13 （33+4）个原子。常用3.6 13 -螺旋（n=3）代 表 -螺旋，其中3.6表示每圈螺旋含3.6个氨基 酸残基（非整数螺旋），3.6下角的13表示氢 键封闭的环内含13个原子。 氢键取向与主 轴基本平行 右旋，3.6个氨基 酸一个周期，螺 距0.54 nm 第n个AA(NH)与第n-4 个 AA(CO)形成氢键， 环内原子数13。 3 10 - 3 10 - n=2 3 10 3 2+4 =- 49 0 =-26 0 - -turn Pauling 3.010 helix π16 helix α helix 第 X 个氨基酸的氨基与（X－n）个氨基酸的羧基之间形成氢键 环内原子数 N＝3n+1 - 蛋白质中的 -螺旋几乎都是右手的，右手 的比左手的稳定。前提是螺旋都是由L-氨基酸 残基组成的，因此右手螺旋和左手螺旋不是对 映体。左手螺旋中L-型氨基酸残基侧链的第一 个碳原子（C  )过于接近主链上C=O的氧原子， 以致结构不舒适，能量较高，构象不稳定。而 右手螺旋中，空间位阻较小，较为符合立体化 学空间要求，在肽链折叠中容易形成，构象稳 定。左手螺旋虽然稀少，但偶尔也有出现。 -conformation -sheet -turn - -构象也称-折叠、-结构、-折叠片， 是蛋白质中第二种最常见的二级结构。两条或 多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起， 相邻肽链主链上的-NH和C=O之间形成有规则 的氢键，这种构象为-构象。在-构象中，所 有的肽键都参与链间氢键的交联，氢键与肽链 的长轴接近垂直，在肽链的长轴方向上具有重 复单位。除作为某些纤维蛋白质的基本构象外， -构象还普遍存在于球状蛋白质中。-构象分 为两种类型：平行式(parallel)和反平行式 (antiparallel)。 （1）是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯 齿状，相邻肽键平面间呈110°角。氨基酸残基的R侧 链伸出在锯齿的上方或下方。 （2）依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C＝O 与HN形成氢键，使构象稳定。 （3）两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。即 前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是 反方向的。β－片层结构的形式十分多样，正、反平行 能相互交替。 （4）平行β－片层结构中，两个氨基酸残基的间距为 0.65 nm；反平行β－片层结构，则间距为0.7 nm。 β 反平行β－片层结构中，两个残基之间的间距为0.7 nm。 平行β－片层结构中，两个残基的间距为0.65 nm。 - - C -C  R - 7.0 Å - 6.5 Å =- 119 0 =+113 0 =-139 0 =+135 0 180 β (β turn β bend) β -C O -NH - -turn) - -转角（-turn）也称回折（reverse turn）、-弯曲（-bend）或发夹结构（hairpin structure），是球状蛋白质中发现的另一种二 级结构。有三种类型（两种主要），每个类型 都有4个氨基酸残基，弯曲处的第一个氨基酸残 基的C=O和第四个氨基酸残基的NH之间形成一 个41氢键，产生一个不很稳定的环形结构， 连接 -螺旋或-构象。Gly及Pro残基常出现在- 转角处，前者因为小和可变，后者因为肽键中 Pro的亚氨氮通常是顺式构型。 - -转角常出现在球状蛋白质的表面附近，这里，肽基中间的 两个氨基酸残基能与水形成氢键。 10 I型是II型出现几率的2倍多，I型和II型的关系在于中心肽单位旋转了180 0 。 II型转角总有Gly残基作为第三个残基（C 3 ），否则由于空间位阻不能形成 氢键。 III - III - 3 10 - III I C 1 C 2 Pro以外的氨基酸残基形成的肽键，99.95%是反式构 型，但由Pro亚氨氮形成的肽键中，约6%的肽键为顺 式构型，而这些多数出现在-转角位置。 β (β bugle) β β β β Random coil 无规则卷曲或称卷曲(coil)，泛指那些不能 被归入明确的二级结构如折叠片或螺旋的多肽区 段。这些区段大多数既不是卷曲，也不是完全无 规则的，存在少数柔性的无序片段。它们也像其 他二级结构那样是明确而稳定的结构，否则蛋白 质就不可能形成三维空间上每维都具周期性结构 的晶体。它们受侧链相互作用的影响很大，经常 构成酶活性部位和其他蛋白质特异的功能部位， 如许多钙结合蛋白中结合钙离子的EF手结构 （E-F hand structure)的中央环。 RNase • - - • Pro Gly - - Fibrous Proteins -Keratin, collagen and silk fibroin nicely illustrate the relationship between protein structure and biological function. 广泛分布于脊椎和无脊椎动物，是动物体的基本支架和外保护 成分，占脊椎动物体内蛋白质总量的一半甚至更多。分子是有 规则的线性结构，与多肽链的有规则的二级结构有关，而有规 则的二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。 纤维状蛋白质拥有相同的特性，为它们所存在 的结构提供强度和/或弹性，基本的结构单位是 简单的重复的二级结构。所有的纤维状蛋白质 不溶于水，与它们的分子的内部及表面含有高 浓度的疏水性氨基酸残基有关。 ( -Keratin) • 角蛋白包括皮肤及其衍生物发、毛、鳞、羽、甲、蹄、 角、爪、丝等，为结构蛋白。 • -角蛋白中，两股（或三股）右手 -螺旋向左缠绕， 拧成一根原纤维(protofibril)（直径2 nm)，再排列成 “9+2”的电缆式结构—微纤维(microfibril)（直径为8 nm），数百根微纤维结合成不规则纤维束—大纤维 （macrofibril)，直径200 nm。 • 角蛋白含有丰富的二硫键，每四个螺旋就有一个交联 二硫键，保证了纤维结构的稳定和强大刚性。 • -角蛋白在湿热条件下可转变为-构象，冷却干燥又 回复原状。也有天然存在的-角蛋白，如丝心蛋白 (fibroin)，是典型的反平行折叠片。 keratin right handed helix Structure of Hair two strands of -keratin, oriented in parallel are wrapped about each other- suppertwisted coiled coil suppertwisting amplifies the strength of the structure 初原纤维：由两股缠绕的螺旋进一步形成 原纤维 32 strands of -keratin About four protofibrils-32 strands of - keratin altogether- combine to form an intermediate filament. -角蛋白中螺旋多肽链间有着丰富的二硫键交联， 是当外力解除后肽链恢复原状的重要力量。 Collagen • 也称胶原，动物骨、腱、软骨、皮肤的结构蛋白， 有四种以上类型。 • I型胶原蛋白在体内以胶原纤维形式存在，基本单位 是原胶原蛋白分子(tropocollagen)，长度280 nm，直 径1.5 nm，Mr 300000。原胶原蛋白分子经多级聚合 形成胶原纤维。 • Rich认为胶原蛋白的二级结构是由3条多肽链组成的 三股螺旋，是一种右手超螺旋结构，螺距8.6 nm，每 股每圈包含30个氨基酸残基，其中的每一股螺旋是 一种特殊的左手螺旋，螺距0.95 nm，每一螺圈3.3个 氨基酸残基，每一残基沿轴距离0.29 nm。胶原三螺 旋只存在于胶原纤维中，肽链的96%按（Gly-x-y) n 的 三联体重复出现，Gly的数目占残基的三分之一，x 通常为Pro，y通常为Hypro和Hylys。 • 一是螺旋间的范德华力，二是螺旋间的氢键，三是链 间的共价交联。 • 除这三种力之外，稳定三螺旋结构还要三联体的每第 三个位置必须是Gly。单股螺旋每圈是3.3个氨基酸残 基，三股超螺旋的每圈每股是10个三联体，因此每第 三个C 就必然靠近超螺旋中心轴，只有在轴上没有 侧链出现，即只有Gly，才能得到致密的有氢键键合 的稳定结构。氢键在一条链三联体的Gly的酰胺氢与 另一条链的相邻三联体的羰基氧间形成。Hypro也参 与链间氢键的形成。 • 链间的共价交联主要在Lys和Hylys残基间形成，III 型胶原还有链间二硫键。 Collagen Collagen is 35% Gly, 11% Ala, and 21% Pro and Hypro. Repeating tripeptide unit Gly-X-Pro or Gly-X-Hypro. 左旋的 肽链 截面图 Structure of Collagen Gly S t r u c t u r e o f C o l l a g e n F i b r i l s 胶原（Mr 300000）为棒 状分子，长约 3000 Å，只有 15 Å的厚度。 三股缠绕的螺 旋链可能有不 同的序列，但 每一条约有 1000个氨基酸 残基。 - • 不是所有的多肽都能形成稳定的 -螺旋的，氨基酸侧 链的相互作用能够稳定或破坏这种结构。Poly-Ala在 pH7的水溶液中能自发形成 -螺旋，而poly-Lys或 poly-Glu在同样的条件下不能形成 -螺旋，而是以无 规则形式存在，侧链彼此排斥不能形成链内氢键。但 在pH12时，poly-Lys即自发形成 -螺旋。 • 除R基团的带电性质外，R基的大小对形成 -螺旋也 有影响，poly-Ile由于 -C附近有较大的R基，造成空 间阻碍，不能形成螺旋。Poly-pro不具备亚氨基，不 能形成链内氢键，只要存在Pro (或Hypro)， -螺旋 即被中断，并产生一个“结节”(kink)。 Asp Arg