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　　蛋白质高级结构 一条多肽链绕假象的中心轴旋转 ① 二面角：Φ= -57°,= - 47°，是一种右手螺旋。 ②每3.6个氨基酸绕一圈，螺距 0.54nm;每个氨基酸残基绕轴旋转100° ，沿轴上 升0.15nm ③ R侧链基团伸向螺旋的外侧。 ④ 氢键的取向几乎与中心轴平行。 ⑤ 肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键（ α13 ）。 ● R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。 如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α-螺旋。 溶液的pH值决定了侧链是否带有电荷，由单一一种氨基酸构成的聚合物只有当侧链不带电荷时才能形成α-螺旋，相邻残基的侧链上带有同种电荷会产生静电排斥力从而阻止多肽链堆积成α-螺旋构象。 Lys侧链的pK为10.5，当pH值远远高于10.5时，多聚赖氨酸大多数侧链为不带电荷的状态，该多肽可能形成一种α-螺旋构象，在较低的pH值时带有许多正电荷的分子可能会呈现出一种伸展的构象。 不同来源胰岛素肽链中A8, A9, A10, B1, B2, B27 和B30 位置上的氨基酸残基(其它的氨基酸相同) 3、酶原（proenzyme）和 激素原(prohormone)的激活 定义：在体内处于无活性状态的酶前身物（酶原，proenzyme）或激素原(prohormone)在一定条件下被修饰转变成有活性的酶或激素的过程称酶原或激素原的激活。 2. 胰岛素原和胰岛素样品同时在SDS上 电泳。画出电泳的预期结果。 3.研究人员用胰岛素做蛋白质的变性复性实验。当通过透析去掉尿素和?-巯基乙醇后只有不到10% 的活性得到恢复。然而当用胰岛素原重复这个实验的时候100%的活性通过复性得到了恢复。解释这些实验结果。 4. 用胰岛素而不是用胰岛素原治疗糖尿病患者。你认为这是一个好主意吗? 当在高pO2情况下，如在肺部（大约100 Torr）时，肌红蛋白和血红蛋白对氧的亲和性都很高，两者几乎都被饱和了。 然而当处于低于大约50 Torr以下的pO2时，肌红蛋白对氧的亲和性明显要比血红蛋白对氧的亲和性高得多。 在肌肉等组织的毛细管内，由于pO2低（20－40 Torr），血红蛋白对氧的亲和性低，所以红细胞中血红蛋白载有的很多氧被释放出来，释放出来的氧都可被肌肉中的肌红蛋白结合。 肌红蛋白和血红蛋白对氧亲和性的差异形成了一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。 T form R form 氧合作用显著改变Hb的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从T态→R态） T态（tense state）紧张态 R态（relaxed state）松驰态。 血红素中的二价铁原子在与氧结合的前后，并不发生价数的改变 别构（变构）效应是指含亚基的蛋白质分子由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子构象、性质和功能发生变化的效应。 血红蛋白是别构蛋白，O2结合到一个亚基上以后，影响与其它亚基的相互作用。 增加CO2的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放; 反之，高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H+ 和CO2 。 5. H＋、CO2和DPG对血红蛋白结合氧的影响 1）波耳（Bohr）效应 H+和CO2促进HbO2释放O2 (pH7.6) (pH7.2) 2） 2，3一二磷酸甘油酸(BPG / DPG)对Hb氧合的影响 Or 2, 3 - Bisphosphoglycerate (BPG) BPG通过与Hb的两个β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力，使血红蛋白的曲线向右偏移。 当没有BPG时，在氧分压大约为20Torr时，血红蛋白几乎被氧饱和了，不能将它结合的氧卸载给肌红蛋白。然而在等摩尔的BPG存在下，20Torr时只有三分之一的血红蛋白被氧饱和。 所以BPG的别构效应使得血红蛋白在组织中氧分压低的情况下可以将氧转给肌红蛋白。? 总之，各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。 八、蛋白质的分离、纯化和鉴定 盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。 盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜， 中和表面的净电荷。 2.有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。 有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。 3.重金属盐沉淀（条件：pH 稍大于pI为宜）：在蛋白质溶液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。 重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。 4.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石” 5.弱酸或弱碱沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。 弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷。 （一）蛋白质一级结构与功能的关系 1．镰刀状红细胞贫血病（sickle-cell anemia） 七、蛋白质结构与功能的关系 分子病：由于基因突变导致机体合成蛋白质一级结构的改变，从而引起生物功能的障碍，而产生先天性疾病，这就是分子病。 4,000～10,000/ml 15,250/ml White cell count 14～18g/100ml 8g/100ml Hemoglobin content 4.6～6.2×106/ml 2.6×106/ml Red cell count Normal range Observed 血常规检测 HbA（ adult hemoglobin） HbS（sickle-cell hemoglobin） 1954年 Ingram V等人 指纹图谱（finger print） 水平为电泳,垂直为层析 HbA HbS HbA β-链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys… HbS β-链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys… 由于这个aa的差别，使血红蛋白溶解度下降至1/25；输氧功能降低，使红细胞呈镰刀状，不容易通过毛细血管；同时细胞易破碎，导致红细胞的减少。 异常血红蛋白β链的第6位谷氨酸被缬氨酸所代替。这个疏水氨基酸正好适合另一血红蛋白分子β链EF角上的“口袋”，这使两条血红蛋白链互相“锁”在一起，最终与其他血红蛋白链共同形成一个不溶的长柱形螺旋纤维束，使红细胞扭旋成镰刀形。 2、同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化 定义：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质 通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。 同源蛋白质一级结构（序列）的特点： ① 同源蛋白质氨基酸序列具有明显的相似性 ② 有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。 除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能， 。 ③ 多肽链长度相同或相近。 胰岛素 ● 始终不变残基：A．B链上6个Cys 不变，其余 不变的氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的 空间结构起重要作用。 ● 可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用 不大，但对免疫反应起作用。 问题1：什么动物是胰岛素的最佳来源？解释你的答案。 前胰岛素原 胰岛素原 胰岛素 问 题 1、复性实验表明，蛋白质一级结构决定蛋白质的空间结构。 2、蛋白质一级结构的变化导致空间结构的变化，可以使蛋白质功能丧失。 3、蛋白质一级结构的切除可以使蛋白质由非活性状态转化成活性（激活）。 （二）蛋白质一级结构与高级结构的关系 （三）蛋白质的空间结构与功能的关系 以血红蛋白（Hb)的结构与功能为例 α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似， Hb接近于球体，4个亚基分别在四面体的四 个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。 成人： HbA： α2β2 98% HbA2： α2δ2 2% 胎儿： HbF： α2γ2 1. 血红蛋白的结构 亚基与亚基之间通过非共价键缔和在一起 2.血红蛋白中血红素辅基的结构 任何亚基吸收氧分子后都会牵动骨架 3．血红蛋白与氧的结合(氧合曲线/氧解离曲线．血红蛋白的别构效应(变构效应) （allosteric effect） 四个亚基之间具有正协同效应， 氧合曲线是S型曲线。 开始，氧的结合要比肌红蛋白对氧的结合慢（在脱氧血红蛋白中，亚基之间的连接比较紧密），这种构象不利于O2的结合，而当第一亚基与氧结合后，增加了其余亚基对氧的亲和力。 反之，当氧分压降低时，从氧合血红蛋白失去一个氧分子，将引起其余的氧分子更易解离，说明各亚基间存在一种协同效应。 β-曲折（β-meander）： 是三条或三条以上反平行的β-折叠通过短链，如β-转角相连。 β-折叠筒（β-sheat barrel）： 结构域是 1970年Edelman提出的，它是指在较大的球状蛋白质分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就是结构域。 也叫辖区，是蛋白质三维结构中的一个层次。 结构域 对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。 4. 蛋白质的三级结构 定义:一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布，称为三级结构，是包括主、侧链在内的空间排列。 1963年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的x-射线衍射分析，测得了它的空间结构。 肌红蛋白(Mb)是由一条多肽链折叠盘绕成近似球状的构象。 (2) 主链的75%是右手螺旋，其余为无规卷曲，一条多肽链 共有8个螺旋区（A、B、C、D、E、F、G、H），7个非螺 旋区（二个在末端，中间有五个）。 (3) 氨基酸残基的亲水基团几乎全部分布在分子的表面，而疏水基团几乎全部在分子的内部。 (4) 血红素辅基垂直地伸出分子表面，通过一个His残基和分子内部相连。 细胞色素C的三级结构 蛋 白 质 His-N Met-S 维持三级结构的作用力 主要靠次级键（非共价键）维系固定，主要有： 1、 氢键 2、离子键(配位键) 3、范德华力 4、疏水的相互作用 另外二硫键（共价键）也参与维系三级结构。 5.蛋白质的四级结构 四级结构是二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链(亚基或亚单位(subunit))，彼此借次级键相连，形成一定的空间结构，称为四级结构。实质是亚基在空间排列的方式 （亚基是指一条多肽链或以共价链连接在一起的几条多肽链组成的蛋白质分子的最小共价结构单位） 血红蛋白（hemoglobin）是由四个亚基组成，2个α-亚基，2个β-亚基，每个亚基由一条多肽链与一个血红素辅基组成 。４个亚基以正四面体的方式排列，彼此之间以非共价键相连（主要作用力是疏水作用，二硫键，离子键，氢键等。） 。 四级缔合在结构和功能上的优越性 1、降低比表面积，增加蛋白质结构的稳定性 2、提高遗传经济性和效率。 3、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。 4、具有协同效应和别构效应，实现对酶活性 的调节 共价键 次级键 化学键 肽键 一级结构 氢键 二硫键 二、三、四级结构 疏水键 盐键 范德华力 三、四级结构 6.维持蛋白质构象的化学键 纤维状蛋白质的构象 角蛋白α-螺旋间以S-S连接增加稳定性，硬角蛋白（甲、角等）比软角蛋白（毛发）有更多二硫键。 （2）丝心蛋白（也称丝蛋白，fibroin） 反β－折叠 （3）胶原蛋白（collagen） 六、蛋白质的理化性质 蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似。 但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物，也就出现了一些新的性质。 （一）胶体性质 蛋白质主要是指球状蛋白质有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体-透析，布朗运动，丁达尔现象。 1.蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。 2.蛋白质在非等电点时带有同种电荷，与周围相反电荷形成双电层。同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。 （二）酸碱性质和等电点 1. 蛋白质分子的可解离基团 2. 等电点 每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。 等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。 3．蛋白质等电点的测定 等电聚焦电泳 （Isoelectric focusing electrophoresis, IFE） 等电聚焦电泳是一种电泳的改进技术，实际上是利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH 梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质（ampholytes）。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。 等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。 + + － － － － + － － － － － 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 通电 + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － (三) 变性作用（denaturation） 1 . 蛋白质变性的概念： 天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。 2．变性的因素 物理因素: 加热、紫外线、X-射线、超声波等。 化学因素: 酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂 （尿素、盐酸胍）、重金属盐等。 3. 变性的本质： 分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。 4．变性蛋白质的特性 （1）生物活性全部或部分丧失 。 （2）一些物化性质的改变：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，可滴定基团增加。 （3）生化性质的改变：对酶的作用敏感，易被水解。 5．变性的可逆性 （四）凝固作用 变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固。 变性不一定凝固，凝固一定变性 （五）蛋白质的沉淀作用 蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀 * * 指:蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。 构型是指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排列. 构象是指相同构型的化合物中,与碳原子相连的各原子或取代基团, 当单键旋转时，形成的相对的空间排布。 蛋白质的空间结构（三维结构） 蛋白质的空间结构（三维结构） 1. 蛋白质空间结构的研究方法 (1) X-射线衍射法（X-ray diffraction method） (2) 核磁共振（NMR） (3) 光谱法（红外光谱、紫外差光谱、荧光光谱） (4) 旋光色散法（optical rotatory dispersion, ORD） (5) 园二色性（circular dichroism, CD） (6) 氢同位素交换法 早在20世纪30年代，Pauling和Corey就开始有X-射线衍射方法研究了氨基酸和肽的结构，他们得到了重要的 结论: (1) 肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有部分双键的性质， 不能自由旋转。 (2) 肽键中的四个原子和它相邻的两个α-碳原子处于同一平面，形 成了酰胺平面，也称肽平面。 肽平面是刚性平面结构 (3) 在酰胺平面中C=0与N-H呈反式。 Cα-N键的旋转角度叫φ角， Cα-C的旋转角度叫

　　角。 二面角决定了两个肽平面的相对位置，因此就决定了肽链主链的位置与构象。 可允许的Φ和值 ——拉氏构象图(Ramachandran diagram) 蛋白质的二级结构是指多肽链本身的折叠和盘绕方式。 2.蛋白质的二级结构 二级结构类型 螺旋结构 β -折叠 回折 β -发夹和 Ω环 三股螺旋 无规卷曲 (1) α-螺旋（α-helix） 1950年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白质时，提出了α-螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在α-螺旋。 按每一圈AA残基数分 非整螺旋 右手螺旋稳定 左手螺旋 （嗜热菌蛋白酶） 整数螺旋 按螺旋旋转方向分 螺旋结构的种类 有关螺旋的写法，用“nS”来表示，n为螺旋上升一圈氨基酸的残基数。S为氢键封闭环内的原子数，典型的α-螺旋用3.613表示，非典型的α-螺旋有3.010， 4.416（π螺旋）等。 一些侧链基团虽然不参与螺旋，但他们可影响α-螺旋的稳定性 连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，α-螺旋就不稳定。 ● 在多肽链中只要出现Pro，Hypα-螺旋就被中断，产生一个弯曲（bend）或结节（kink）。 ● Gly的R基太小，难以形成α-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。 ● 肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成α-螺旋。 ● （为什么？ ） ？ pH对α-螺旋的影响？ 解 释 (2) β-折叠（β- sheet）/β-片层 也是pauling等人提出来的，它是与α-螺旋完全不同的一种结构。 是一种较伸展的锯齿形的主链构象。两个氨基酸残基之间的轴心距＝0.35nm 形成β -折叠的条件是： R比较小，一般不带电荷。 β-Sheet: 折叠特点 (1) 肽链平行排列，相邻肽链主链上的N-H和 C=O之间形成氢键,侧向连接。 (2)多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链R基交 替地分布在片层平面的两侧。 (3)肽链走向为同向(parallel)或反向排列。 平行β折叠 (3) β-转角 (β-turn) 也叫回折，β – 弯曲 β-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180o的回折，在回折上的结构就称β-转角，也称发夹结构，或称 U 形转折。 由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N—H之间形成氢键。 (4) 无规卷曲（Random Coil） 无规卷曲是指没有规律性的肽链结构，但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。 无规卷曲与其他二级结构一样是明确而稳定的结构。 (5) Ω环 这是最近发现普通存在于球状蛋白质中的一种新的二级结构，这种结构的形状象希腊字Ω，所以称Ω环。 Ω环这种结构总是出现在蛋白质分子的表面，而且以亲水残基为主，这种结构与生物功能有关，另外在分子识别中可能起重要作用。 3.蛋白质的超二级结构和结构域 超二级结构是1973年Rossmann提出的，它是由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。 * * * β转角的特征： ① 由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。 ② 主链骨架以180°返回折叠。 ③ 第一个aa残基的C=O与第四个aa残基 的 N-H生成氢键 ④ C1α 与C4α之间距离小于0.7nm ⑤ 多数由亲水氨基酸残基组成。