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　　Biochemistry 生物化学 蛋白质的结构与功能 第1章 StructureandFunctionofProtein 蛋白质的概念和生物学重要性第一节蛋白质的分子组成第二节蛋白质的分子结构第三节蛋白质结构与功能的关系第四节蛋白质的理化性质第五节蛋白质的分离纯化 主要内容 学习指导 重点 1 蛋白质的生物学重要性 2 蛋白质的分子组成特点和基本单位 3 蛋白质的分子结构及其与功能的关系 难点 1 蛋白质的结构与功能的关系 2 蛋白质分离纯化的原理 进展 1 蛋白质模体和结构域 2 分子伴侣及其作用 概述 蛋白质存在于所有的生物细胞中 是构成生物体最基本的结构物质和功能物质 蛋白质是生命活动的物质基础 它参与了几乎所有的生命活动过程 蛋白质的概念和生物学重要性 蛋白质的一些功能 荧光素酶 luciferase 催化荧光素蛋白与ATP的反应而产生荧光 红血球含有大量的氧转运蛋白 血红蛋白 hemoglobin 脊椎动物产生的角蛋白是毛发 蹄 角 羊毛 指甲 羽毛等组织的主要结构成分 如黑犀牛的角 a b c 什么是蛋白质 蛋白质 protein 是由许多氨基酸 aminoacids 通过肽键 peptidebond 相连形成的高分子含氮化合物 蛋白质研究的历史 1833年 从麦芽中分离淀粉酶 随后从胃液中分离到类似胃蛋白酶的物质 1864年 血红蛋白被分离并结晶 19世纪末 证明蛋白质由氨基酸组成 并合成了多种短肽 20世纪初 发现蛋白质的二级结构 完成胰岛素一级结构测定 20世纪中叶 各种蛋白质分析技术相继建立 促进了蛋白质研究迅速发展 1962年 确定了血红蛋白的四级结构 20世纪90年代 功能基因组与蛋白质组研究地展开 蛋白质的生物学重要性 分布广 所有器官 组织都含有蛋白质 细胞的各个部分都含有蛋白质 含量高 蛋白质是细胞内最丰富的有机分子 占人体干重的45 某些组织含量更高 例如脾 肺及横纹肌等高达80 1 蛋白质是生物体重要组成成分 作为生物催化剂 酶 代谢调节作用免疫保护作用物质的转运和存储运动与支持作用参与细胞间信息传递 2 蛋白质具有重要的生物学功能 3 氧化供能 第一节 蛋白质的分子组成TheMolecularComponentofProtein 组成蛋白质的元素 主要有C H O N和S 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁 铜 锌 锰 钴 钼 个别蛋白质还含有碘 这些元素在蛋白质中的组成百分比约为 各种蛋白质的含氮量很接近 平均为16 由于体内的含氮物质以蛋白质为主 因此 只要测定生物样品中的含氮量 就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量 100克样品中蛋白质的含量 g 每克样品含氮克数 6 25 100 1 16 蛋白质元素组成的特点 蛋白质含量的测定 凯氏定氮法 测定氮的经典方法 优点 对原料无选择性 仪器简单 方法也简单 缺点 易将无机氮 如核酸中的氮 都归入蛋白质中 不精确 除了上法外 还有紫外比色法 双缩脲法 Folin 酚 考马斯亮兰G 250比色法 条件 蛋白质必须是可溶的 Melamine 三聚氰胺 Poisonousmilkpowder case Poisonousmilkpowder incident Nitrogencontent 66 7 化学组成 两种类型 因此 蛋白质是由氨基酸构成的聚合物 一 组成人体蛋白质的20种氨基酸均属于L 氨基酸 存在自然界中的氨基酸有300余种 但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种 且均属L 氨基酸 甘氨酸除外 氨基酸 aminoaicd 组成蛋白质的基本单位 氨基酸的一般结构 构成蛋白质的氨基酸有20种均为 氨基酸 脯氨酸例外 共同结构为在同一碳原子上有羧基 氨基与氢不同点为侧链R不同 赖氨酸 脯氨酸 亚氨基酸 C N H 3 C O O H 不对称碳原子 甘氨酸除外 A 氨基酸都具有旋光性 B 每一种氨基酸都具有D 型和L 型两种立体异构体 目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L 型 二 氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类 20种L型氨基酸在pH7 0时的结构及分类 R为脂肪族基团的AAR为芳香族基团的AAR为含硫基团的AAR为含醇基基团的AAR为碱性基团的AAR为酸性基团的AAR为含酰胺基团的AA Gly无旋光性侧链疏水Ile有4种可能的立体异构体 因其 碳是不对称碳 L Ile D Ile L 别构Ile D 别构IleAla Val Leu Ile侧链高度疏水Pro为亚氨基酸 R为脂肪族基团的AA Phe Trp侧链疏水 Tyr侧链亲水UV特征吸收 Phe的 max 257nm 257 2 0 x102 Tyr的 max 275nm 275 1 4x103 Trp的 max 280nm 280 5 6x103 R为芳香族基团的AA pH6 0 附 Lambert Beer法测定蛋白质含量 大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸 测定溶液280nm吸收 可根据Lambert Beer公式计算蛋白质含量 Met侧链疏水Met又称蛋氨酸Cys侧链亲水Cys的巯基类似弱酸 pK 8 4 R为含硫基团的AA 某些蛋白质水解时 可分离到胱氨酸 它是由两个半胱氨酸通过一个二硫键连接而成 二硫键 或称二硫桥 在稳定某些蛋白质的三维结构中起着重要作用 Ser Thr含 羟基其 羟基参与很多酶的活性部位反应Thr类似Ile 有四种立体异构体 R为含醇基基团的AA 侧链亲水侧链有碱性基团其侧链 His含咪唑基Lys含 氨基Arg含 胍基Arg是20种AA中碱性最强的AA 侧链胍基基团pK 12 5 R为碱性基团的AA 侧链亲水侧链有酸性基团其侧链 Asp含 羧基Glu含 羧基Glu单钠盐是调味品味精 R为酸性基团的AA Asp Glu的酰胺化产物 侧链不带电荷侧链亲水侧链强极性 常存在于蛋白质表面可与其它AA极性侧形成氢键 R为含酰胺基团的AA 非蛋白质氨基酸 三 20种氨基酸具有共同或特异的理化性质 两性解离及等电点 氨基酸是两性电解质 其解离程度取决于所处溶液的酸碱度 等电点 isoelectricpoint pI 在某一pH的溶液中 氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等 成为兼性离子 呈电中性 此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点 一 氨基酸具有两性解离的性质 pH pI pH pI pH pI 氨基酸的兼性离子 阳离子 阴离子 pH1710净电荷 10 1正离子兼性离子负离子等电点pI 甘氨酸 二 含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质 色氨酸 酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近 大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基 所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法 芳香族氨基酸的紫外吸收 pH6 0 三 氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物 氨基酸与茚三酮水合物共热 可生成蓝紫色化合物 其最大吸收峰在570nm处 由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系 因此可作为氨基酸定量分析方法 与茚三酮的反应 颜色反应 氨基酸氧化脱氨 生成NH3 醛 放出CO2 水合茚三酮变为还原型茚三酮 NH3 水合茚三酮与还原型茚三酮缩合成蓝紫色化合物 四 蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链 肽键 peptidebond 是由一个氨基酸的 羧基与另一个氨基酸的 氨基脱水缩合而形成的化学键 一 氨基酸通过肽键连接而形成肽 peptide 甘氨酰甘氨酸 肽键 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物 两分子氨基酸缩合形成二肽 三分子氨基酸缩合则形成三肽 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全 被称为氨基酸残基 residue 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽 oligopeptide 由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽 polypeptide N末端 多肽链中有游离 氨基的一端C末端 多肽链中有游离 羧基的一端 多肽链有两端 多肽链 polypeptidechain 是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构 N末端 C末端 牛核糖核酸酶 二 体内存在多种重要的生物活性肽 1 谷胱甘肽 glutathione GSH GSH过氧化物酶 GSH还原酶 NADPH H NADP GSH与GSSG间的转换 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽 neuropeptide 2 多肽类激素及神经肽 小结 蛋白质的基本组成单位是L 氨基酸 其结构特点氨基酸按其侧链的结构和理化性质分类 第二节 蛋白质的分子结构TheMolecularStructureofProtein 蛋白质的分子结构包括 一级结构 primarystructure 二级结构 secondarystructure 三级结构 tertiarystructure 四级结构 quaternarystructure 定义 蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N 端至C 端的氨基酸排列顺序 一 氨基酸的排列顺序决定蛋白质的一级结构 主要的化学键 肽键 有些蛋白质还包括二硫键 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础 但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素 二 多肽链的局部主链构象为蛋白质二级结构 主要的化学键 氢键 一 参与肽键形成的6个原子在同一平面上 参与肽键的6个原子C 1 C O N H C 2位于同一平面 C 1和C 2在平面上所处的位置为反式 trans 构型 此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 peptideunit 螺旋 helix 折叠 pleatedsheet 转角 turn 无规卷曲 randomcoil 二 螺旋结构是常见的蛋白质二级结构 蛋白质二级结构 螺旋 Hydrogenbonds 每个helix 3 6AA0 54nm AA侧链 柱体外侧 a Formationofaright handed helix b showingtheintrachainhydrogenbonds The HelixIsaCommonproteinSecondaryStructure 氨基酸序列影响 Helix稳定性 theinteractingAsp red andArg blue sidechains 氨基酸侧链可影响其结构的稳定性 如 Pro或Gly残基 Pro 其氨基氮原子缺少hydrogenatom 改变Helix方向 终止 Helix Thestructureofmyoglobin Myoglobin 8 helices Fibrousproteins 1 Keratin 角蛋白 角蛋白 PermanentWavingIsBiochemicalEngineering 三 折叠使多肽链形成片层结构 The conformationofpolypeptidechains Fibroin 丝心蛋白 天然的 角蛋白 Fibrousproteins 2 四 转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在 转角 无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构 turn turn 转角 turns 常见Pro或Gly残基 五 模体是具有特殊功能的超二级结构 在许多蛋白质分子中 可发现二个或三个具有二级结构的肽段 在空间上相互接近 形成一个有规则的二级结构组合 被称为超二级结构 二级结构组合形式有3种 二个或三个具有二级结构的肽段 在空间上相互接近 形成一个特殊的空间构象 称为模体 motif 模体是具有特殊功能的超二级结构 钙结合蛋白中结合钙离子的模体 锌指结构 螺旋 转角 或环 螺旋模体链 转角 链模体链 转角 螺旋 转角 链模体 模体常见的形式 六 氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响 蛋白质二级结构是以一级结构为基础的 一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成 螺旋或 折叠 它就会出现相应的二级结构 三 在二级结构基础上多肽链进一步折叠形成蛋白质三级结构 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置 即肽链中所有原子在三维空间的排布位置 定义 一 三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置 疏水键 离子键 氢键和VanderWaals力等 肌红蛋白 Mb ProteinTertiaryStructure Theoverallthree dimensionalarrangementofallatomsinaproteinisreferredtoastheprotein stertiarystructure 纤连蛋白分子的结构域 二 结构域是三级结构层次上的局部折叠区 分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密的区域 并各行其功能 称为结构域 domain 三 分子伴侣参与蛋白质折叠 分子伴侣 chaperon 通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开 如此重复进行可防止错误的聚集发生 使肽链正确折叠 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合 使之解聚后 再诱导其正确折叠 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用 Polypeptidesfoldrapidlybyastepwiseprocess ProteinFolding ProteinFolding ProteinFolding 伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用 亚基之间的结合主要是氢键和离子键 四 含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用 称为蛋白质的四级结构 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链 每一条多肽链都有完整的三级结构 称为蛋白质的亚基 subunit 由2个亚基组成的蛋白质四级结构中 若亚基分子结构相同 称之为同二聚体 homodimer 若亚基分子结构不同 则称之为异二聚体 heterodimer 血红蛋白的四级结构 五 蛋白质的分类 根据蛋白质组成成分 根据蛋白质形状 六 蛋白质组学 一 蛋白质组学基本概念 蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质 即 一种基因组所表达的全套蛋白质 二 蛋白质组学研究技术平台 蛋白质组学是高通量 高效率的研究 双向电泳分离样品蛋白质蛋白质点的定位 切取蛋白质点的质谱分析 三 蛋白质组学研究的科学意义 蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein 第三节 一 一级结构是空间构象的基础 一 蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础 UreaMercaptoethanol 天然状态 有催化活性 尿素 巯基乙醇 去除尿素 巯基乙醇 非折叠状态 无活性 二 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能 三 氨基酸序列提供重要的生物化学信息 一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素 cytochromeC 比较它们的一级结构 可以帮助了解物种进化间的关系 四 重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病 例 镰刀形红细胞贫血 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病 称为 分子病 肌红蛋白 血红蛋白含有血红素辅基 血红素结构 二 蛋白质的功能依赖特定空间结构 一 血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似 肌红蛋白 myoglobin Mb 肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质 有8段 螺旋结构 血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连 加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2 形成配位结合 所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合 血红蛋白 hemoglobin Hb 血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构 每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧 Hb亚基之间通过8对盐键 使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合 Hb与O2结合后称为氧合Hb 氧合Hb占总Hb的百分数 称百分饱和度 随O2浓度变化而改变 二 血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合 肌红蛋白 Mb 和血红蛋白 Hb 的氧解离曲线 协同效应 cooperativity 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后 能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象 称为协同效应 如果是促进作用则称为正协同效应 positivecooperativity 如果是抑制作用则称为负协同效应 negativecooperativity 血红素与氧结合后 铁原子半径变小 就能进入卟啉环的小孔中 继而引起肽链位置的变动 变构效应 allostericeffect 蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化 称为变构效应 三 蛋白质构象改变可引起疾病 蛋白质构象疾病 若蛋白质的折叠发生错误 尽管其一级结构不变 但蛋白质的构象发生改变 仍可影响其功能 严重时可导致疾病发生 蛋白质构象改变导致疾病的机理 有些蛋白质错误折叠后相互聚集 常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀 产生毒性而致病 表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变 这类疾病包括 人纹状体脊髓变性病 老年痴呆症 亨停顿舞蹈病 疯牛病等 疯牛病是由朊病毒蛋白 prionprotein PrP 引起的一组人和动物神经退行性病变 正常的PrP富含 螺旋 称为PrPc PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为 折叠的PrPsc 从而致病 疯牛病中的蛋白质构象改变 小结 蛋白质各级结构的特点 维系键 天然蛋白质要有活性必需具备完整的三级或四级结构 蛋白质一级结构是空间结构的基础 特定的空间结构是特定生物学功能的基础 第四节 蛋白质的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein 一 蛋白质具有两性电离的性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外 氨基酸残基侧链中某些基团 在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团 当蛋白质溶液处于某一pH时 蛋白质解离成正 负离子的趋势相等 即成为兼性离子 净电荷为零 此时溶液的pH称为蛋白质的等电点 蛋白质的等电点 isoelectricpoint pI 二 蛋白质具有胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一 分子量可自1万至100万之巨 其分子的直径可达1 100nm 为胶粒范围之内 颗粒表面电荷水化膜 蛋白质胶体稳定的因素 水化膜 带负电荷的蛋白质 溶液中蛋白质的聚沉 三 蛋白质空间结构破坏而引起变性 在某些物理和化学因素作用下 其特定的空间构象被破坏 也即有序的空间结构变成无序的空间结构 从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失 蛋白质的变性 denaturation 造成变性的因素 如加热 乙醇等有机溶剂 强酸 强碱 重金属离子及生物碱试剂等 应用举例 临床医学上 变性因素常被应用来消毒及灭菌 此外 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂 如疫苗等 的必要条件 若蛋白质变性程度较轻 去除变性因素后 蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能 称为复性 renaturation 天然状态 有催化活性 尿素 巯基乙醇 去除尿素 巯基乙醇 非折叠状态 无活性 在一定条件下 蛋白疏水侧链暴露在外 肽链融会相互缠绕继而聚集 因而从溶液中析出 变性的蛋白质易于沉淀 有时蛋白质发生沉淀 但并不变性 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块 此凝块不易再溶于强酸和强碱中 蛋白质沉淀 蛋白质的凝固作用 proteincoagulation 四 蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸 因此在280nm波长处有特征性吸收峰 蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系 因此可作蛋白质定量测定 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热 呈现紫色或红色 此反应称为双缩脲反应 双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度 五 应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量 茚三酮反应 ninhydrinreaction 双缩脲反应 biuretreaction 第五节 蛋白质的分离纯化与结构分析TheSeparationandPurificationandStructureAnalysisofProtein 概述 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合形式存在 每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质 蛋白质的分离 separation isolation 和纯化 purification 工作是生物化学中一项艰巨而繁重的任务 蛋白质不同 分离纯化及鉴定的方法不同 但涉及类似的生物化学技术 这些技术利用了蛋白质的 大小与形状 溶解度 电荷及酸碱性 吸附性 对配体分子的生物学亲和力上的微小差异 前处理 pretreatment 选择适当方法使蛋白质从组织或细胞中释放 保持天然状态和活性 如 匀浆或超声处理 粗分级分离 roughfractionation 采用适当方法 将所要蛋白质与其他杂蛋白分离开 如 盐析 等电点沉淀有机溶剂分级分离等 离心法分离亚细胞成分 细分级分离 finefractionation 蛋白质样品的进一步纯化 一般使用层析法 包括凝胶过滤 离子交换层析 吸附层析以及亲和层析等 必要时还可选择电泳法 包括区带电泳 等电点聚焦等 分离纯化某一蛋白质的一般程序可以分为3步 一 透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜 达到浓缩蛋白质溶液的目的 透析 dialysis 超滤法 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法 透析和超过滤 透析和超过滤就是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质 使蛋白质和其他小分子物质如无机盐 单糖 水等分开 二 丙酮沉淀 盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法 使用丙酮沉淀时 必须在0 4 低温下进行 丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积 蛋白质被丙酮沉淀后 应立即分离 除了丙酮以外 也可用乙醇沉淀 盐析 saltprecipitation 是将硫酸铵 硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液 使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏 导致蛋白质沉淀 盐溶与盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响 低浓度增加蛋白质溶解度 称为盐溶 saltingin 当离子强度增加到足够高时 如饱和或半饱和程度 很多蛋白质从水溶液中沉淀出 此现象称为盐析 saltingout 等电点沉淀与pH控制 蛋白质是带有正电荷和负电荷的两性电解质 带电基团的电荷数量则因pH不同而变化 当蛋白质处于等电点pH时 蛋白质的净电荷为零 由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀 免疫沉淀法 将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体 利用特异抗体识别相应的抗原蛋白 并形成抗原抗体复合物的性质 可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白 三 利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒 在电场中能向正极或负极移动 这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术 称为电泳 elctrophoresis 根据支撑物的不同 可分为薄膜电泳 凝胶电泳等 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 常用于蛋白质分子量的测定 等电聚焦电泳 通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法 双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术 几种重要的蛋白质电泳 电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳条带 等电聚焦电泳 双向电泳 大肠杆菌 E coli 裂解液的IFE SDS PAGE双向电泳图 四 应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离 待分离蛋白质溶液 流动相 经过一个固态物质 固定相 时 根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小 电荷多少及亲和力等 使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 层析 chromatography 分离蛋白质的原理 离子交换层析 利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离 凝胶过滤 gelfiltration 又称分子筛层析 利用各蛋白质分子大小不同分离 蛋白质分离常用的层析方法 五 利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离 超速离心法 ultracentrifugation 既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量 适用球状蛋白 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数 sedimentationcoefficient S 表示 沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 密度梯度离心法 蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小 而且也取决于它的密度 如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时 质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快 如分离亚细胞结构 六 应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段 分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序 一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法 并分析出各肽段中的氨基酸顺序 然后经过组合排列对比 最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 七 应用物理学 生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定 二级结构测定通常采用圆二色光谱 circulardichroism CD 测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量 螺旋的CD峰有222nm处的负峰 208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分 而 折叠的CD谱不很固定 三级结构测定X射线衍射法 X raydiffraction 和核磁共振技术 nuclearmagneticresonance NMR 是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法 同源模建 将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐 补偿氨基酸替补 插入和缺失 通过模建和能量优化计算 产生目标序列三维结构 序列相似性越高 预测的模型也越准确 折叠识别 通过预测二级结构 预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构 从而产生目标序列的三维结构 从无到有 根据单个氨基酸形成二级结构的倾向 加上各种作用力力场信息 直接产生目标序列三维结构 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 本章总结 蛋白质是最重要的生物大分子之一 其基本组成单位是L 氨基酸 氨基酸的英文三字符及分类 蛋白质的一级结构的概念 主要连接键 肽键 蛋白质的空间结构 二 三 四级 维系键 次级键 蛋白质一级结构 空间结构和生物学功能的关系 利用蛋白质的理化性质对其进行分离 纯化和检测 1 检测食品中蛋白质含量的原理和方法是什么 必做 2 20种编码氨基酸的中文名 英文三字符 酸性和碱性氨基酸 3 蛋白质的一级结构与核酸的关系 4 蛋白质二级结构的类型 5 维持蛋白质三级结构稳定的次级键 6 模体 结构域 7 蛋白质的结构与功能的关系 8 蛋白质变性及其实质 9 蛋白质的紫外吸收性质 10 分离蛋白质的基本方法及原理 思考题 附 蛋白质结构与功能的关系 了解蛋白质的三维结构是理解蛋白质如何行使功能的基础蛋白质功能总是跟蛋白质与其他分子的相互作用相联系以球状蛋白为例 如 肌红蛋白 血红蛋白 抗体 酶等 来理解蛋白质结构与功能的关系 一 肌红蛋白的结构与功能 肌红蛋白 myoglobin Mb 是哺乳动物细胞主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质 潜水哺乳动物如海豹和海豚的肌肉中肌红蛋白含量十分丰富肌红蛋白由一条多肽链 称珠蛋白 globin 和一个辅基血红素 heme 构成 Mb的三级结构 肌红蛋白Mb 广泛存在于肌细胞中的贮氧蛋白潜水哺乳动物有比陆生哺乳动物有更高的含量单体结合蛋白 珠蛋白 血红素 亲水性残基几乎全在外侧疏水性残基在内半疏水性残基部分暴露 含8个 螺旋 A B H 占总组成153个残基中的3 4 非螺旋区NA AB BC GH HC 不规则卷曲 一个疏水裂隙中含有一个血红素辅基 其中心为Fe原子 His93 F8 和His64 E7 与血红素辅基结合 血红素 血红素 卟啉环 卟啉的充填模型 F8His残基 卟啉环平面 Fe的6个配位键 其中4个与卟啉环的N连接 1个与O2连接 血红素 O2与肌红蛋白的结合 如果Fe以三价存在 则Fe3 将与水结合而不能再O2结合血红素周围疏水环境的存在能够保护Fe2 不被氧化为Fe3 游离的血红素Fe与CO的直线结合 游离血红素CO结合力比O2结合力强2500倍 而肌红蛋白CO结合力比O2结合力强250倍 为什么 空间位阻 E7His的存在使CO无法以直线排列形式与Fe结合因此Mb与CO结合力下降 因为HisE7的存在 O2不能与Fe以直线排列形式结合 氧合改变Mb构象 去氧MbFe位于卟啉环靠近HisF8一侧卟啉环圆顶状向HisF8凸出 氧合MbFe被拉回到卟啉环平面卟啉环圆顶状转为平面HisF8牵拉F螺旋 Mb氧结合曲线 肌红蛋白结合氧的定量分析 或 Mb氧结合曲线Pa 二 血红蛋白的结构与功能 血红蛋白 hemoglobin Hb 的主要功能是在血液中结合并转运氧气 还能运输H 和CO2 存在于血液的红细胞中 血红蛋白的结构 4个亚基 氧合过程中的构象变化Hb的氧结合曲线别构效应 协同性 一 Hb的结构 亚基组成 人体内有正常功能的血红蛋白 各种亚基由相对应的基因表达生成 三级结构具有相似性胎儿HbF之 链143位为Ser 非电离 为His 正电 因此 链不能和BPG 负电 结合 HbF的氧合能力更强 利于从胎盘获得氧 Hb的各亚基及Mb三维结构非常相似 去氧Hb亚基Fe位于卟啉环靠近HisF8一侧卟啉环圆顶状向HisF8凸出 氧合Hb亚基Fe被拉回到卟啉环平面卟啉环圆顶状转为平面HisF8牵拉F螺旋 T态 紧张态 R态 松驰态 二 氧结合引起Hb构象改变 构象改变 三 Hb的氧结合曲线 8Pa n 4吗 实际上 n 2 8 1 n 4 Hill方程 结论 Hb和O2的结合是高度协同的 但不完全是 全 或 无 的现象 协同效应 就是增加血红蛋白在肌肉中的卸O2效应 四 Hb的别构效应 协同性氧合 血红蛋白是一种典型的别构蛋白质别构效应别构部位与配体的结合可影响其他亚基 使这些亚基构象改变 增强或减弱对底物的结合协同效应正协同效应 引起与配体结合能力的增强 激活 负协同效应 引起与配体结合能力的减弱 抑制 血红蛋白的正协同效应一个O2的结合改变其它亚基的构象 使Hb从T态向R态转化 增强了其他亚基与O2的结合力Hb的正协同效应使Hb既容易和O2结合 又容易和O2分离 利于O2从肺部运输至组织细胞Hb除能运输O2外 还能运输CO2和H 酸的缓冲 H 和CO2促进O2的释放 Bohr效应 pH的降低使S曲线右移 即氧合能力降低 促使O2解离组织呼吸释放CO2 CO2进入红细胞H2O CO2 H2CO3 H HCO3 H 促使Hb O2解离 因而有利于从肺向组织运送O2H 和CO2结合于Hb从组织运送到肺部 HCO3 从血浆运送至肺肺部的高氧分压使O2与Hb结合 促使H 和CO2解离 H 与HCO3 结合为H2CO3 然后分解为H2O和CO2经肺排出H 是Hb氧合的别构抑制剂碳酸酐酶 红细胞 肺泡细胞 肾小管细胞 思考 Bohr效应的生理学意义 提示 有利于血红蛋白释放O2缓冲血液pH值CO2的运输和释放 BPG降低Hb对O2的亲和力 去氧Hb的中央孔穴最大 与BPG结合力最强 Hb O2 4中央孔穴最小 不能与BPG结合 O2 BPG与Hb的结合是互相排斥的组织处BPG与Hb的结合有利于O2的释放肺部的氧合过程驱使BPG离开HbBPG是Hb氧合的别构抑制剂BPG是红细胞无氧氧化的产物 BPG与Hb的结合使曲线右移 无BPG时肺部结合的O2几乎不能在组织释放海平面处红细胞中的BPG摩尔数与Hb相等 约为4 5mmol L 从肺部运送到组织的O2约38 被释放进入海拔4500m时 组织获得的O2降至30 2天后BPG增加到7 5mmol L 组织获得的O2升高至37 思考 解释高原适应性的机理 提示 BPG降低Hb对O2的亲和力 PTC 氨基酸混合物HPLC的洗脱图 其中一种氨基酸分析方法是 酸水解后 用苯异硫氰酸酯 PITC 处理蛋白质水解液 pH9 生成苯硫脲 PTC 氨基酸衍生物 经HPLC按疏水特性分离 254nm处测光吸收 确定其浓度 Trp W 三 Edman降解 由Edman于1950年公布的一项新的氨基酸序列的测定技术 Edman降解法 苯异硫氰酸酯法 即PITC法 为 NH2的反应 用于N末端分析 Edman降解测序主要涉及耦联 水解 萃取和转换等4个过程 苯乙内酰硫脲衍生物 PTH 氨基酸 苯氨基硫甲酰肽 PTC 肽 噻唑啉酮苯胺 ATZ 减少一个残基的肽 F3CCOOH 酸性水溶液 二硫桥的断裂 甲酸氧化法和巯基化合物还原法 四 多肽裂解与序定 Edman降解法通常测定的多肽长度在40个残基以内 因此 测定大的蛋白质氨基酸序列需要将其降解为一些肽段 然后分别对这些肽段进行Edman降解测序 蛋白质降解常用的是一些水解酶和化学试剂 常用蛋白水解酶 胰蛋白酶 trypsin 断裂以Arg和Lys为C 末端残基的肽段 和胰凝乳蛋白酶 chymotrypsin 断裂Phe Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键 a b c 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 两种蛋白酶的水解部位和蛋白序列的确定 肽的化学合成 多肽化学合成 液相合成固相合成 一 液相合成 多肽合成的基本过程是20世纪初由EmilFischer设计的 称为液相合成法 合成方向N端 C端二肽合成如右图 二 固相合成 1962年R BruceMerrifield在多肽合成技术方面取得突破性进展 R BruceMerrifield 合成方向C端 N端二肽合成如图 二环已基碳二亚胺 挂接 去保护 第一个氨基酸 氨基被保护 第二个氨基酸 氨基被保护 二环已基脲 缩合 去保护和断裂 固相合成的优点 固相合成反应物和产物都连接在固相载体上 可在一个反应容器中进行所有的反应 便于自动化操作 固相合成加入过量的反应物可获得高产率的产物 同时产物很容易分离 非极性脂肪族氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸 二 氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类 一 侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸 二 侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸 三 侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸 四 侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸 五 侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸 几种特殊氨基酸 脯氨酸 亚氨基酸 半胱氨酸 胱氨酸