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　　特别地，与SEQ ID NO:15的序列相比，本发明提供的血清白蛋白结合ISVD通常具有(有限的)数量的“氨基酸差异”(如本文所述)。这些氨基酸差异可存在于CDR中(只要所得的氨基酸序列使它们保留本文所列的本发明氨基酸序列的另外的性质即可)和/或存在于构架区中，且可特别地存在于构架区中(根据Kabat和/或根据Abm定义)。例如但不限于，这些氨基酸差异可以是例如人源化取代，改善在所需宿主细胞或宿主生物体中表达的取代，改善稳定性和/或对降解和/或蛋白酶抗性的取代，降低预先存在的抗体的结合的突变，和/或旨在优化本发明氨基酸序列的序列的其他突变；或这些氨基酸差异的任何适当组合。参考本文的进一步公开内容。

　　特别地，根据本发明的一个具体方面，根据本发明的不同方面的血清白蛋白结合物优选使得它们(至少)结合非线性表位，所述非线性表位似乎包含人血清白蛋白一级序列中氨基酸残基区段的一个或更多个下列区段中的一个或更多个氨基残基：位置298-311(且特别是Met298、Pro299、Ala300、Asp301、Leu302、Pro303、Ser304、Leu305、Ala306和Glu311中的一个或更多个)；位置334-341(且特别是Tyr334、Arg337、His338、Pro339和/或Asp340中的一个或更多个)和/或位置374-381(且特别是Phe374、Asp375、Phe 377、Lys378和Val381中的一个或更多个)，根据Meloun等人,FEBS Letters,1975,58,p.134-137中给出的编号对人血清白蛋白中的氨基酸残基进行编号。参考下面实施例7中给出的晶体结构数据。

　　不受任何具体假设或机制的限制，基于以下实验部分中给出的晶体结构数据，假定人血清白蛋白上的这些氨基酸残基是SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物与其结合的表位的一部分，并且所提及的氨基酸相互作用是该结合中涉及的一些最重要的相互作用。因此，优选地，本发明的白蛋白结合物使得它们结合至人血清白蛋白上的与SEQ ID NO:15基本上相同的氨基酸残基和/或表位，甚至更优选使得它们共享与SEQ ID NO:15基本上相同的氨基酸相互作用。为此目的，根据具体但非限制性的方面，本发明的白蛋白结合物优选地具有与序列SEQ ID NO:15相同的CDR，或者与SEQ ID NO:15的序列相比，优选地在其CDR中仅包含这样的突变(例如保守氨基酸取代)，所述突变仍然允许它们进行与SEQ ID NO:15相同或基本相同的与人血清白蛋白的氨基酸相互作用。

　　根据本发明的不同方面的血清白蛋白结合物通常优选还使得它们在人血清白蛋白和来自于至少一种、优选至少两种、更优选至少三种以及直至基本上所有下列哺乳动物物种的血清白蛋白之间交叉反应：大鼠、小鼠、兔、豚鼠、猪、羊、牛和食蟹猴。特别地，根据本发明的不同方面的血清白蛋白结合物可使得它们在人血清白蛋白和来自大鼠血清白蛋白、小鼠血清白蛋白和来自于食蟹猴的血清白蛋白中的至少一种、优选至少两种、更优选所有三种之间(至少)交叉反应。在这方面，与具有和Alb-11和/或Alb-23D(基本上)相同的CDR的血清白蛋白结合物相比，本发明的血清白蛋白结合物可以具有改善的交叉反应性(特别地，在一方面是人血清白蛋白和另一方面是大鼠和/或小鼠血清白蛋白之间)。

　　对于可降低预先存在的抗体结合的适当的突变(以及这些突变的适当的组合)，例如参考WO2012/175741和WO2015/173325以及例如参考WO2013/024059和WO2016/118733。如其中所述，这种突变可包含一个或更多个氨基酸取代、缺失或添加(特别是取代)(的适当的组合)，这些突变通常位于ISV的所谓C端区域。例如，此类突变可包括位置11、13、14、15、40、41、42、82、82a、82b、83、84、85、87、88、89、103、108中的一个或更多个位置的突变(并且特别是取代)，和/或在C-端VTVSS序列中一个或更多个位置的突变(即位置109、110、111、112和113)，在位置11、89、110和/或112处的一个或更多个突变是特别优选的。这种突变的一些优选但非限制性的实例是在突变后，在指定位置，存在以下氨基酸残基之一的适当的取代(如果需要)：11L、11K、11V、14A、14P、41A、41L、41P、41S、41T、42E、42G、87A、87T、89A、89L、89T、108L、110K、110Q、112K和/或112Q(11L、89A、89L、89T、110K、110Q、112K和112Q是特别优选的)；或这些取代的任何适当组合，例如但不限于：11V与89L或89T组合；11V与110K或110Q组合；或11V与89L和110K或110Q组合。降低预先存在的抗体结合的此类突变也可以适当地与本文所述的一个或更多个其他突变(例如与一个或更多个人源化取代)组合。

　　为了降低预先存在的抗体的结合，本发明的血清白蛋白结合物(和如本文进一步所述，本发明的化合物)适当时(如本文进一步所述，特别是当本发明的血清白蛋白结合物存在于和/或形成其存在其中的本发明化合物的C-端末端时)还可以包含C-端延伸(例如C-端丙氨酸残基)。如WO2012/175741中所述，这种C-端延伸降低预先存在的抗体结合。合适的C-端延伸可通常在本文中被进一步描述，且可特别地具有式-(X)n，其中X可以是任何天然存在的氨基酸(但优选不是半胱氨酸)，且n可以是1、2、3、4或5。再次参考WO2012/175741，也可参考例如WO2015/173325、WO2013/024059和WO2016/118733。这种C-端延伸的存在也可以适当地与本文描述的一个或更多个其他突变(例如与一个或更多个人源化取代和/或一个或更多个降低预先存在的抗体结合的突变)组合。

　　可存在于本发明的氨基酸序列(即通过它们自身或以适当的组合)中的氨基酸残基的一些优选但非限制性实例(即与SEQ ID NO:15的氨基酸序列相比的突变)包括：11V(即L11V)、14P(即A14P)、47F(即R47F)、49A(即V49A)、74S(即A74S)、75N(即E75N)、83R(即K83R)、89L(即V89L)、89T(即V89T)、110K(如T110K)或110Q(如T110Q)；以及在适当的情况下(如本文进一步描述的)，1D(如E1D)和/或如本文定义的C-端延伸(X)n(例如114A)。又参考附图4A和4B中所示的序列和突变。例如，这些氨基酸残基的适当组合的一些优选但非限制性的实例(即与SEQ ID NO:15的氨基酸序列相比的突变)包括：

　　如本文进一步所述，本发明提供的氨基酸序列是可以与人血清白蛋白结合，特别是可以特异性地(如本文所述)结合的蛋白质。因此，它们可以用作结合单元或结合结构域用于结合(人)血清白蛋白，例如以便赋予治疗化合物、结构部分或实体半衰期(如本文所定义)的增加。对于利用血清白蛋白结合结构域来增加治疗化合物、结构部分或实体的血清半衰期，参考例如WO 2004/041865、WO 2006/122787、EP 2 139 918、WO 2011/006915、WO 2012/175400和/或WO2014/111550。本发明的血清白蛋白结合物通常可以与这些参考文献中描述的血清白蛋白结合物以相同的方式和以相同的目的使用。

　　)。除非本文另有明确说明，通常优选基于和/或衍生自重链可变结构域的ISVD(例如VH或VHH结构域)。最优选地，除非本文另有明确说明，ISVD是纳米抗体。-术语“纳米抗体”通常如在WO 2008/020079或WO 2009/138519中所定义，并且因此在具体方面中通常指VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH(例如骆驼源化的人VH)或通常指序列优化的VHH(如例如关于化学稳定性和/或溶解性、与已知人构架区的最大重叠和最大表达优化的)。注意术语纳米抗体(Nanobody)或纳米抗体(Nanobodies)是Ablynx N.V.的注册商标，并且因此也可称为和/或-通常，除非本文另有说明，本文提及的ISVD、纳米抗体、多肽、蛋白和其他化合物和构建体旨在用于预防或治疗人类疾病或病症(和/或任选地也用于温血动物，特别是哺乳动物)。因此，通常，本文所述的ISVD、纳米抗体、多肽、蛋白和其他化合物和构建体优选使得它们可以被用作(生物)药物或其他药学或治疗活性化合物和/或药物产品或组合物，和/或可以适当地作为其一部分。这种药物、化合物或产品优选适合于对人类给药，例如用于需要这种预防或治疗的受试者的预防或治疗或例如作为临床试验的一部分。如本文进一步所述，为此目的，除了本发明提供的ISVD之外，这种药物或化合物可以含有其他结构部分、实体或结合单元(如本文所述，其可以是例如一个或更多个其他另外的治疗结构部分和/或影响基于ISVD或基于纳米抗体的生物制品的药代动力学或药效学性能如其半衰期的一个或更多个其他结构部分)。这些另外的治疗剂或其他结构部分的适当的实例对于技术人员是清楚的，并且例如一般可包括任何治疗活性的蛋白、多肽或其他结合结构域或结合单元，以及例如修饰如在WO 2009/138159的第149-152页上所述的那些。基于ISVD的生物制品或基于纳米抗体的生物制品优选是治疗剂或旨在用作治疗剂(其包括预防和诊断)，并且为此目的优选地包含至少一种针对治疗相关靶标(如例如RANK-L、vWF、IgE、RSV、CXCR4、IL-23或其他白细胞介素等)的ISVD。对于这种基于ISVD或基于纳米抗体的生物制品的一些具体但非限制性的实例，参考实施例8至18，并且还例如参考Ablynx N.V.的各个申请(如例如但不限于WO 2004/062551、WO 2006/122825、WO2008/020079和WO 2009/068627)，以及例如(但不限于)申请如WO 2006/038027、WO 2006/059108、WO 2007/063308、WO 2007/063311、WO2007/066016和WO 2007/085814。此外，如本文进一步描述的，另外的结构部分可以是如本文所述的针对(人)血清蛋白例如(人)血清白蛋白的ISVD或纳米抗体，并且这样的ISVD或纳米抗体也可特别地在和/或延长本文所述TNF结合物的半衰期中具有治疗用途。例如，参考WO 2004/041865、WO 2006/122787和WO 2012/175400，其通常描述血清白蛋白结合纳米抗体用于延长半衰期的用途。此外，在本说明书中，除非本文另有明确说明，本文提及的所有术语具有WO 2009/138519(或WO 2009/138519中引用的现有技术)或WO 2008/020079(或WO 2008/020079中引用的现有技术)中给出的含义。此外，在本文未具体描述方法或技术的情况下，可以如WO 2009/138519(或在WO 2009/138519中引用的现有技术)或WO 2008/020079(或在WO 2008/020079引用的现有技术中所述)所述进行。此外，如本文所述，包含任何ISVD或本发明化合物的任何药物产品或组合物还可包含一种或更多种本身已知的用于药物产品或组合物的另外组分(即取决于预期的药物形式)和/或例如一种或更多种旨在用于治疗用途的另外化合物或活性组成部分(即提供组合产品)。

　　此外，当在本说明书或权利要求书中使用时，以下术语具有与在WO 2009/138519的第62-75页上给出的含义相同的含义，和/或如果适用时可以以在该页上所述的方式进行确定：“激动剂”、“拮抗剂”、“逆激动剂”、“非极性、不带电荷的氨基酸残基”、“极性不带电荷的氨基酸残基”、“极性、带电荷的氨基酸残基”、“序列同一性”、“精确相同”和“氨基酸差异”(当提及两个氨基酸序列的序列比较时)、“(以)基本分离的(形式)”、“结构域”、“结合结构域”、“抗原决定簇”、“表位”、“针对”或“针对”(抗原)、“特异性”和“半衰期”。此外，术语“调节(modulating)”和“待调节(to modulate)”、“相互作用位点”、“特异于”、“交叉阻断(cross-block)”、“交叉阻断的(cross-blocked)”和“交叉阻断(cross-blocking)”和“基本上独立于pH”，如在Ablynx N.V.的WO2010/130832的第74-79页上所定义(和/或可如在该页上所述确定)。此外，当提及本发明的构建体、化合物、蛋白质或多肽时，术语如“单价”、“二价”(或“多价”)、“双特异性”(或“多特异性”)和“双互补位”(或“多互补位”)可以具有在WO 2009/138519、WO 2010/130832或WO 2008/020079中给出的含义。

　　在本文使用时，关于本文提及的ISVD、纳米抗体、基于ISVD的生物制品、基于纳米抗体的生物制品或任何其他氨基酸序列、化合物或多肽的术语“半衰期”一般可以如WO 2008/020079的第57页上的段落o)中所述定义，并且如本文提及时，指在体内例如由于通过天然机制降解序列或化合物和/或清除或隔离(sequestration)序列或化合物而使氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度减少50％所需的时间。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以任何本身已知的方式测定，例如通过药代动力学分析。适当的技术对于本领域技术人员是清楚的，并且可以例如通常如WO 2008/020079的第57页上的段落o)中所述。也如在WO 2008/020079的第57页上的段落o)中所提及，可以使用参数如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示半衰期。在该方面，应该注意术语“半衰期”在本文中使用时特别指t1/2-β或终末半衰期(其中t1/2-α和/或AUC都可不予考虑)。例如，参考下下面的实验部分及标准手册，如Kenneth,A等人:Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists和Peters等人,Pharmacokinetic analysis:A Practical Approach(1996)。还参考了“Pharmacokinetics”，M Gibaldi和D Perron，由Marcel Dekker出版，第2版(1982)。类似地，术语“半衰期增加”或“增加的半衰期”也如WO 2008/020079的第57页上的段落o)中所定义，并且特别是指t1/2-β的增加，或者具有或不具有t1/2-α和/或AUC或两者的增加。

　　。此外，如本文已经指出的，纳米抗体的氨基酸残基根据Kabat等人给出的VH的一般编号进行编号。(“Sequence of proteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91)，如Riechmann和hods 2000Jun 23；240(1-2):185-195文章中应用于来自骆驼科动物的VHH结构域；或在本文提及的。根据该编号，纳米抗体的FR1包含在位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包含在位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包含在位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包含在位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包含在位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包含在位置95-102的氨基酸残基，并且纳米抗体的FR4包含在位置103-113的氨基酸残基。[在这方面中，应该注意，如本领域所熟知的，对于VH结构域和VHH结构域，每个CDR中的氨基酸残基总数可以变化，并且可以不对应于由Kabat编号表示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或更多个位置可以不由实际序列占满，或者实际序列可能包含多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这一般意为，根据Kabat编号可以对应于或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。然而，通常一般来说，根据Kabat的编号并且不考虑CDR’s中氨基酸残基的数目，根据Kabat编号的位置1对应于FR1的开始并且反之亦然，根据Kabat编号的位置36对应于FR2的开始并且反之亦然，根据Kabat编号的位置66对应于FR3的开始并且反之亦然，根据Kabat编号的位置103对应于FR4的开始并且反之亦然]。用于对VH结构域的氨基酸残基进行编号的备选方法是Chothia等人(Nature 342，877-883(1989))描述的方法，该方法也可以以类似方式应用于来自骆驼科动物的VHH结构域和纳米抗体，被称为“AbM定义”和被称为“接触定义”。然而，在本说明书、方面和附图中，除非另有说明，将遵循由Rabchmann和Muyldermans应用于VHH结构域的根据Kabat的编号。

　　当本发明化合物在其C-端具有一个ISVD(例如本发明的血清白蛋白结合物或针对治疗靶标的ISVD)时，则所述C-端ISVD(并且因此，引申开来，本发明的整个化合物)优选在其C-端末端具有C-端延伸。该C-端延伸将直接与ISVD的最终C端氨基酸残基相连，其通常是根据Kabat在位置113的氨基酸残基(除非ISVD含有一个或更多个氨基酸缺失，使得ISVD的序列在位置113之前结束)。因此，通常，C-端延伸将直接与C-端ISV的C-端VTVSS序列(SEQ ID NO:78)(并且因此，引申开来，本发明化合物的C-端TVTSS序列)或对应于C-端ISVD序列的C-端ISVD的C-端序列(例如，与常规的VTVSS序列相比，所述C-端ISVD的C-端序列含有一个或更多个取代或缺失，如T110K、T110Q、S112K或S112K)连接。

　　还优选地，当本发明的化合物在其C-端末端具有ISVD(例如本发明的血清白蛋白结合物或针对治疗靶标的ISVD)时，则(至少)所述C-端ISVD优选地，甚至更优选地，除了如本文所述的C-端延伸之外，含有一个或更多个降低预先存在的抗体结合的突变(即如本文所述的本发明的血清白蛋白结合物，并且更普遍地如WO 2012/175741和WO 2015/173325以及又例如在WO2013/024059和WO2016/118733中所述)。在这方面，技术人员清楚的是，在本发明的化合物在其C-端末端末端具有本发明的血清白蛋白结合物的情况下，则(至少)本发明的所述血清白蛋白结合物优选将包含这种突变(即优选地除了C-端延伸之外)。

　　本发明的一些具体的多特异性和/或多价多肽的一些其他实例可以在本文提及的Ablynx N.V.的申请中找到。特别地，对于包含至少一种用于增加半衰期的针对血清蛋白的纳米抗体的多价和多特异性构建体、编码其的核酸、包含其的组合物、上述的制剂和上述的应用的一般描述，参考上述国际申请WO 04/041865和WO 06/122787(本文所述的本发明的血清白蛋白结合物通常可类似地用于本文描述的半衰期增加的纳米抗体，例如Alb-8)，以及参考在例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627中给出的此种构建体的一般描述和具体实例。

　　通常，为了预防和/或治疗本文所述的疾病和病症，并且取决于待治疗的具体疾病或病症、待使用的本发明化合物或多肽的效力和/或半衰期、具体的给药途径和所用的具体药物制剂或组合物，本发明的化合物或多肽通常以每千克体重每日1克和0.01微克之间的量给药，优选每千克体重每日0.1克和0.1微克之间给药，例如每千克体重每日约1、10、100或1000微克，作为单日剂量连续地(例如通过输液)，或日间作为多个分剂量。临床医生通常能够根据本文所述的因素确定适当的日剂量。还将清楚的是，在具体情况下，临床医生可以选择偏离这些量，例如基于上面引用的因素和其专家判断。通常，从对于相当的常规抗体或通过基本上相同的途径施用的针对相同靶标的抗体片段的通常施用的量，可以获得关于施用量的一些指导，然而同时考虑亲和力/亲合力、功效、生物分布、半衰期的差异和技术人员熟知的类似因素。

　　白蛋白在血液中的长半衰期主要由两个特征驱动：(i)白蛋白的大尺寸(65kDa)限制其肾小球过滤和(ii)白蛋白在低pH(pH6)下与FcRn结合，其通过从早期内体再循环至细胞外环境，保护白蛋白在内皮细胞和上皮细胞中被动内吞作用后免于溶酶体降解。对于通过白蛋白结合和随后的再循环导致长血清半衰期的白蛋白结合纳米抗体，它们应在5.0至7.4的pH范围内保持与白蛋白结合。如上所述在ProteOn仪器上测量在pH 5、pH 6和pH 7.4下SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物自HSA的解离速率，将包括SEQ ID NO:1的血清白蛋白结合物作为参考。在HBS-P+pH 7.4缓冲液中分别以500nM和300nM注射SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物和SEQ ID NO:1的血清白蛋白结合物(参考)。解离缓冲液分别为50mM NaOAc/HOAc+150mM NaCl+0.05％Tween-20pH 5.0、50mM NaOAc/HOAc+150mM NaCl+0.05％Tween-20pH 6.0和HBS-P+pH 7.4。将解离进行分析2700秒。从表2中所示的数据可以看出，SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物的解离速率在5.0至7.4的pH范围内没有显著差异。

　　在Sprague Dawley大鼠中，研究包含SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物的本发明代表性化合物(SEQ ID NO:82)在单次静脉注射后的药代动力学，并将其与分别包含SEQ ID NO:79和80的参考血清白蛋白结合物的相似构建体(SEQ ID NO：89和90)进行比较。图3A和3B中给出了SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:1、2、79和80的参考序列的比对。SEQ ID NO:82、89和90的构建体包含通过35GS接头与代表性的纳米抗体(SEQ ID NO:81的抗-HER2纳米抗体)连接的相关的血清白蛋白结合物，以及E1D突变和C-端丙氨酸，并在毕赤酵母中产生。在硼酸盐缓冲液0.2M pH 8.3中，使用N-琥珀酰亚胺基3-

　　I-SIB)进行二价纳米抗体的放射性碘化。没有迹象表明纳米抗体的标记干扰了其与HSA的结合。以3.5-4mCi/mg纳米抗体构建体的比活性，向大鼠投药20μg的125I标记的构建体(每组3只大鼠)。在投药后5min、1h、4h、8h、24h、48h、96h、168h、240h、336h和504h采集血液样品。在每个血液样品中测量放射性，并基于标记的纳米抗体构建体的比活性将其转化为蛋白质浓度。在计算中考虑了放射性标记随时间的衰变。血液中构建体随时间所测量的浓度显示在图9中。通过非隔室分析计算PK参数：相关数据列于表4中。与相比于SEQ ID NO:79和89的参考的对大鼠SA的预期高亲和力一致，对于SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物观察到更高的暴露和降低的清除率。表4：来自大鼠中PK分布的结果。

　　将与SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物复合的人血清白蛋白晶体快速冷冻并在100K的温度下测量。在SWISS LIGHT SOURCE(瑞士菲利根)收集共结晶复合物的衍射数据。数据收集和处理统计数据总结为图7和图8。所得的电子密度图显示所述晶体在不对称单元中含有一个HSA：SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物的复合物，并显示SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物的明确结合模式，其结合至HAS的结构域II。构建结构模型并精制至的最终分辨率。该模型包含SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物的Glul至Ser123残基和HSA的Lys4至Leu583残基。图10中列出了被发现参与SEQ ID NO:15的血清白蛋白结合物与HSA相互作用的主要残基(也参见图11)。